拉曼過(guò)程分析技術(shù)在細(xì)胞治療生物工藝中的應(yīng)用
細(xì)胞療法在治療復(fù)雜疾病方面有著很大的貢獻(xiàn)。隨著越來(lái)越多的這類(lèi)療法得到上市許可，其涉及到的生物工藝也越來(lái)越受到人們更多的關(guān)注，最近來(lái)自細(xì)胞與基因療法制造中心的B Marc-Olivier等人的研究中，使用拉曼光譜作為在線(xiàn)光學(xué)傳感器，檢測(cè)一個(gè)自體T細(xì)胞免疫治療模型的生物工藝過(guò)程，該過(guò)程在一個(gè)生物反應(yīng)器中進(jìn)行。通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)生物學(xué)分析方法測(cè)定參考數(shù)據(jù)，開(kāi)發(fā)了基于拉曼光譜的化學(xué)計(jì)量學(xué)模型，用于測(cè)定葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸鹽和氨的含量，使得對(duì)過(guò)程性能進(jìn)行即時(shí)反饋成為可能。
介紹
在細(xì)胞療法生物過(guò)程中，根據(jù)設(shè)計(jì)質(zhì)量原則(QbD)開(kāi)發(fā)工藝。QbD的一個(gè)關(guān)鍵促成因素是實(shí)施過(guò)程分析技術(shù)(PAT)，在這里，作者展示了拉曼光譜在生物反應(yīng)器系統(tǒng)中監(jiān)測(cè)T細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用。通過(guò)化學(xué)計(jì)量學(xué)建模，以in-line的方式實(shí)時(shí)追蹤代謝過(guò)程的多個(gè)標(biāo)記物，并與以at-line方式測(cè)量的質(zhì)譜和生物分析技術(shù)的測(cè)量結(jié)果相關(guān)聯(lián)。這些結(jié)果顯示，在細(xì)胞療法生物過(guò)程中實(shí)時(shí)在線(xiàn)監(jiān)測(cè)的發(fā)展已經(jīng)向前邁出了重要一步，這為提高細(xì)胞療法生物過(guò)程的一致性開(kāi)辟了新的機(jī)會(huì)。
材料和方法
圖1 ：RamanRxn2原位收集拉曼光譜分析儀
來(lái)自四名健康獻(xiàn)血者的新鮮的外周血，分離CD4+/CD8+細(xì)胞的陽(yáng)性T細(xì)胞，采用300ml微型生物反應(yīng)器系統(tǒng)中進(jìn)行T細(xì)胞活化和擴(kuò)增。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，來(lái)自四個(gè)不同供體的T細(xì)胞庫(kù)平行培養(yǎng)12天。使用相同的四個(gè)T細(xì)胞庫(kù)進(jìn)行了總共三次實(shí)驗(yàn)。每天對(duì)生物反應(yīng)器進(jìn)行取樣測(cè)量葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸和氨濃度的離線(xiàn)參考數(shù)據(jù)。
拉曼光譜用RamanRxn2原位收集拉曼光譜分析儀采集(參見(jiàn)圖1)，配有四個(gè)不銹鋼浸入式探頭。拉曼探頭通過(guò)高壓滅菌進(jìn)行消毒。激光器激發(fā)波長(zhǎng)為785 nm，功率為400 mW，分辨率4cm-1。的光譜收集間隔：進(jìn)行75次掃描，每次掃描10秒。
結(jié)果
所有T細(xì)胞培養(yǎng)物在 300 mL生物反應(yīng)器中保持12天，該反應(yīng)器包含拉曼光譜探頭和pH傳感器、溫度傳感器和DO傳感器。這些過(guò)程持續(xù)12天，第7天最后一次補(bǔ)料，以檢查細(xì)胞對(duì)耗盡的營(yíng)養(yǎng)的反應(yīng)。為了證明初代細(xì)胞材料常見(jiàn)的變異性，對(duì)來(lái)自四個(gè)獨(dú)立供體的白細(xì)胞分離材料進(jìn)行T細(xì)胞計(jì)數(shù)，并在T細(xì)胞分離前后對(duì)CD4和CD8群體進(jìn)行計(jì)數(shù)，供者之間輸入材料中的總T細(xì)胞計(jì)數(shù)在1.42×109到2.89×109之間變化。根據(jù)離線(xiàn)數(shù)據(jù)和模型輸出之間的相關(guān)性，對(duì)最佳模型擬合進(jìn)行了如下排序：葡萄糖(R=0.987)、乳酸(R=0.986)、氨(R=0.936)、谷氨酰胺(R=0.922)和谷氨酸(R=0.829)。葡萄糖、乳酸和谷氨酰胺的化學(xué)計(jì)量學(xué)模型與參考數(shù)據(jù)很好地相關(guān)，并準(zhǔn)確預(yù)測(cè)了從第5天細(xì)胞代謝和增殖率開(kāi)始增加以后，葡萄糖和谷氨酰胺的消耗和乳酸的產(chǎn)生。將與離線(xiàn)測(cè)量相關(guān)的誤差評(píng)估變異系數(shù)(CV)。葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺，谷氨酸和氨的CV分別為0.9%、1.1%、1.2%， 3.7%，和1.7%。細(xì)胞濃度的變異系數(shù)為4.0%，細(xì)胞活力的變異系數(shù)為1.3%。因此，在隨后的分析中觀察到的所有趨勢(shì)都是顯著的。拉曼化學(xué)計(jì)量學(xué)模型以良好的相關(guān)性跟蹤參考測(cè)量值，并顯示了該技術(shù)作為PAT傳感器的潛力(參見(jiàn)圖2，圖3)。
圖2 ：葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸和氨的化學(xué)計(jì)量學(xué)模型，顯示每24小時(shí)收集的參考生物分析儀測(cè)量值與連續(xù)拉曼化學(xué)計(jì)量學(xué)分析之間的相關(guān)性。顯示了所有四個(gè)供體的單個(gè)生物培養(yǎng)過(guò)程的數(shù)據(jù)。
圖3 ：與匹配的單變量拉曼模型相比，所有供體和所有運(yùn)行的細(xì)胞濃度和活力的離散時(shí)間過(guò)程數(shù)據(jù)。
討論
生物反應(yīng)器系統(tǒng)用于細(xì)胞治療的生物培養(yǎng)過(guò)程中，提供在線(xiàn)傳感器，可用于常規(guī)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)物理參數(shù)，如pH、溶解氧和溫度。然而，在培養(yǎng)系統(tǒng)中測(cè)量與細(xì)胞行為相關(guān)的生物學(xué)和功能參數(shù)要復(fù)雜得多。在本研究中，作者應(yīng)用在線(xiàn)拉曼光譜作為光學(xué)傳感器，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)免疫治療生物過(guò)程中T細(xì)胞的代謝和增值。其主要目的是證明利用拉曼光譜監(jiān)測(cè)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(葡萄糖、谷氨酰胺)的消耗和與細(xì)胞代謝相關(guān)的標(biāo)記物(乳酸、谷氨酸和氨)的產(chǎn)生是可行的。
本研究中提供的數(shù)據(jù)證明了在細(xì)胞療法生物過(guò)程中使用拉曼光譜儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞功能行為的潛力。這是第一份應(yīng)用拉曼技術(shù)監(jiān)測(cè)細(xì)胞療法生物模型中營(yíng)養(yǎng)消耗和代謝物產(chǎn)生的報(bào)告。對(duì)這些關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)量的能力可以提供對(duì)工藝性能的即時(shí)反饋，并使拉曼光譜儀成為改進(jìn)未來(lái)細(xì)胞治療制造工藝的一個(gè)有吸引力的PAT系統(tǒng)。
參考文獻(xiàn)
[1] Marc-Olivier, B. , Daniela, B. , Enas, H. , & Damian, M. . (2018). Application of raman spectroscopy and univariate modelling as a process analytical technology for cell therapy bioprocessing. Frontiers in Medicine, 5, 47.
